SARS-CoV-2 поражает поддерживающие клетки обонятельного эпителия

Полная или частичная потеря обоняния сопровождает многие случаи коронавирусной инфекции COVID-19 и часто является единственным специфическим симптомом. Но точный механизм потери обоняния по-прежнему остается неизвестным. Международная группа ученых смогла получить и проанализировать образцы обонятельной области у людей, скончавшихся от COVID-19. Важно, что во всех случаях биопсия была взята в кратчайшие сроки после смерти. Ученые обнаружили, что реплицирующийся вирус SARS-CoV-2 преимущественно поражает поддерживающие клетки обонятельной области, а не сами обонятельные нейроны. Авторы предполагают, что из-за недостаточной функции поддерживающих клеток обонятельные нейроны не могут нормально работать, следствием чего и является потеря обоняния.

Рис. 1. Коронавирус SARS-CoV-2 попадает в организм преимущественно через носовую полость и первым делом заражает эпителий носовой полости. Его основной мишенью является дыхательный эпителий (respiratory epithelium), где он реплицируется преимущественно в реснитчатых клетках (ciliated cells). Бокаловидные (goblet cells) и базальные клетки (basal cells) вирус не затрагивает. Обонятельный эпителий также инфицируется. Хотя в его состав входят обонятельные нейроны (olfactory sensory neurons), они, как показывают авторы обсуждаемого исследования, не являются основным местом размножения вируса, как и базальные клетки. Вирусные частицы реплицируются в поддерживающих клетках обонятельного эпителия (sustentacular cells). Обонятельная луковица (olfactory bulb) считается входом вируса в мозговые ткани. Авторы, исследовав биопсию 68 пациентов, не обнаружили вирусные частицы в аксонах обонятельных нейронов (axons of olfactory sensory neurons), но показали, что они присутствуют в мягкой и паутинной оболочках (leptomeninges), покрывающих обонятельную луковицу.

Симптомы, которые возникают при COVID-19, традиционно связывают с респираторными заболеваниями: высокая температура, сухой кашель, насморк, одышка. Но некоторые симптомы встречаются чаще, чем при простых ОРВИ. Один из них — полная или частичная потеря обоняния у некоторых пациентов (есть данные, что примерно для 25% это первый симптом заболевания, см. R. Kaye et al., 2020. COVID-19 Anosmia Reporting Tool: Initial Findings). Примерно у половины она наблюдается в ходе заболевания (разные метаанализы дают немного разные оценки распространенности этого симптома; например, в статье M. Aziz et al., 2021. The Association of «Loss of Smell» to COVID-19: A Systematic Review and Meta-Analysis на основе учета 11 074 пациентов из 51 исследования получили оценку 52%, а в статье J. Saniasiaya et al., 2020. Prevalence of Olfactory Dysfunction in Coronavirus Disease 2019 (COVID-19): A Meta-analysis of 27,492 Patients на основе учета 27 492 пациентов из 83 исследований — 47,85%). Несмотря на то, что это состояние кажется неопасным (что в том числе приводит к тому, что у нас нет достаточного количества данных о его встречаемости в некоторых регионах мира, например в Восточной Азии), нарушение обоняния может долго сопровождать людей, переболевших COVID-19. Это безусловно снижает качество жизни и может иметь более серьезные долговременные последствия (например, увеличить риск пищевого отравления).

Слизистая носовой полости состоит из двух областей. Дыхательная область покрыта дыхательным эпителием, который содержит бокаловидные клетки (выделяют слизь, необходимую для защитной функции носового секрета), реснитчатые клетки (они продвигают носовой секрет и способны выводить попавшие в него патогены), а также базальные клетки, которые обеспечивают восстановление слизистой оболочки. Под ними располагается базальная мембрана и собственная пластинка (lamina propria), состоящая из рыхлой соединительной ткани. Лишь небольшую часть полости носа занимает обонятельная область. У человека это островки общей площадью 2–4 см², которые располагаются на задней стенке носовой полости. Слизистая обонятельной области состоит из трех основных типов клеток: собственно обонятельных нейронов, дендриты которых покрыты ресничками, взаимодействующими с молекулами, а также поддерживающих клеток (sustentacular cell), выполняющих структурную функцию, и базальных клеток, которые способны к делению и дифференцировке как в поддерживающие клетки, так и в обонятельные нейроны (рис. 2). Под базальными клетками располагается собственная пластинка. Сигнал от обонятельных нейронов через их аксоны, проходящие через решетчатую пластинку, направляется в обонятельную луковицу. Она представляет собой отдел мозга и покрыта мозговыми оболочками: мягкой, а затем паутинной, прилегающей к твердой оболочке. В обонятельной луковице происходит образование синапсов с митральными клетками, через которые стимулы поступают в первичную обонятельную кору, миндалину и гипоталамус. Это приводит к ощущению запаха, а также различным эмоциям и поведению, связанными с ним.

Рис. 2. Обонятельная система человека. (a) — пахучие молекулы попадают в носовую полость, высланную дыхательным эпителием (respiratory epithelium) и островками обонятельного эпителия (olfactory epithelium). Их присутствие улавливается дендритами обонятельных нейронов, аксоны которых проходят через отверстия решетчатой пластинки (cribriform plate) в обонятельную луковицу (olfactory bulb). Там они образуют синапсы с митральными и другими нейронами. Аксоны этих нейронов образуют обонятельный нерв. (b) — обонятельный эпителий состоит из нескольких типов клеток. Сверху они покрыты слизью (mucus), которую выделяют Боуменовы (обонятельные) железы (Bowman’s gland). Реснички (olfactory cilia) на дендритах зрелых обонятельных нейронов (mature olfactory neuron) улавливают пахучие молекулы. Также в эпителии присутствуют клетки с микроворсинками (microvillous cells), функция которых пока неизвестна, и поддерживающие клетки (supporting cells). Нижний слой эпителия состоит из глобулярных (globose) и горизонтальных (horizontal) базальных клеток (basal cells), которые обеспечивают регенерацию поддерживающих клеток и обонятельных нейронов. Аксоны обонятельных нейронов защищены специальными клетками (olfactory ensheathing cells). Рисунок из статьи I. Glezer et al., 2020. Viral infection and smell loss: The case of COVID-19

Несмотря на то, что нарушение обоняния — это распространенный синдром при COVID-19, точный механизм его развития остается неизвестным, и, вероятно, зависит от множества факторов. Самые очевидные из них — это воспаление слизистой оболочки носовой полости, что неудивительно, так как SARS-CoV-2 зачастую попадает в организм через клетки дыхательного эпителия. Но что происходит с обонятельным эпителием? Для входа в клетку вирусу необходимо присутствие рецептора ACE2, а также протеазы TMPRSS2. Рецептор ACE2 присутствует на поверхности разнообразных клеток различных органов, в том числе и центральной нервной системы. Поэтому потенциально вирус может поражать и повреждать как сами обонятельные нейроны, так и клетки обонятельной луковицы.

Летом 2020 года вышло исследование, посвященное возможности вируса проникать в различные элементы обонятельной системы (D. Brann et al., 2020. Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia). Авторы проанализировали уже опубликованные результаты секвенирования РНК отдельных клеток обонятельной системы человека. Этот метод позволяет разделить ткани и органы на различные группы клеток в зависимости от экспрессирующихся в них генов. Они обнаружили, что белок ACE2 экспрессируется преимущественно в поддерживающих и базальных клетках обонятельного эпителия, а также в клетках, окружающих кровеносные сосуды, но не в нейронах. Тем не менее, дальнейшее исследование в рамках данной публикации проводилось преимущественно на мышах и не включало в себя эксперименты с заражением SARS-CoV-2. Поэтому для подтверждения этого наблюдения требовались дальнейшие эксперименты, желательно с задействованием биопсии пациентов, больных COVID-19. Именно такой подход использовали в своей работе исследователи из Бельгии, Германии и США. Статья с ее описанием была опубликована в недавнем выпуске журнала Cell.

Получить биопсии обонятельной области оказалось довольно сложным занятием. Во-первых, при макроскопическом исследовании (с помощью носовых зондов) различить обонятельную и дыхательную область очень трудно. Более того, у человека, в отличие от мышей, она состоит из отдельных труднодоступных островков, запрятанных в носовых раковинах. И если получить биопсию обонятельной области еще возможно, хоть и с примесью дыхательного эпителия, то получить образец обонятельной луковицы у живого человека практически невозможно из-за труднодоступности и необходимости разрушить решетчатую пластинку решетчатой кости. Образцы можно собрать у пациентов post mortem, однако нужно учитывать, что обычно за время от смерти пациента до вскрытия ткани уже начинают разрушаться. Таким образом, авторам исследования потребовалось создать протокол, который позволит получить эти образцы как можно быстрее после смерти пациента.

Как только фиксировалась смерть пациента, предварительно подписавшего согласие на использование своего биоматериала в исследованиях, врачи должны были позвонить дежурной команде отоларингологов. Они использовали эндоскопическую систему, которая обычно используется для операций на основании черепа. Для сбора слизистой обонятельной области они отделяли носовые раковины, а также обонятельную луковицу. Весь процесс занимал не больше полутора часов, что гораздо меньше, чем стандартное время получения образцов при вскрытии. Всего удалось получить образцы от 68 пациентов, скончавшихся от ковида, 15 контрольных пациентов и двух пациентов, которые ранее болели COVID-19, но умерли позже от других причин.

Теперь перед исследователями стояли две задачи. Первая — увидеть различные типы клеток в слизистой обонятельной области и обонятельной луковице. Для этого они использовали метод гибридизации РНК in situ. С помощью этого метода можно пометить отдельные молекулы РНК в клетке с помощью ДНК-зонда, комплементарной целевой молекуле. Использовался улучшенный метод RNAscope, который позволяет увидеть отдельные молекулы РНК в виде точки на микрофотографии (рис. 3). Кроме того, в том же самом образце можно определить расположение белков, специфических для каждого типа клеток с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Рис. 3. Использование RNAscope и иммуногистохимического анализа для исследования образцов слизистой дыхательной и обонятельной областей, а также обонятельной луковицы. Слева — слизистая дыхательной области (respiratory mucosa), в середине — слизистая обонятельной области (olfactory mucosa), справа — обонятельная луковица (olfactory bulb). Верхний ряд — окрашивание гематоксилином и эозином. Оно необходимо для изучения морфологии отобранных образцов. Нижний ряд — изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа. В слизистой дыхательной области присутствует мРНК гена FOXJ1 (зеленый) — маркер клеток мерцательного эпителия. Белок EPCAM (красный) принадлежит эпителиальным клеткам, а MUC5AC (синий) — бокаловидным клеткам и выделяемому ими секрету. В слизистой обонятельной области присутствует мРНК гена OR5A1 (зеленый) — одного из обонятельных рецепторов, которые экспрессируются в обонятельных нейронах, а также мРНК гена OMP (красный). Поддерживающие клетки экспрессируют белок KRT8 (синий). В обонятельной луковице присутствуют белок SSTR2A (маркер паутинной и мягкой оболочек головного мозга, зеленый), а также TUBB3 (синий), который экспрессируется в нейронах. Ядра клеток обозначены белым цветом.

Вторая задача — определить присутствие SARS-CoV-2 в клетках разных типов. Для этого также использовали зонды RNAscope к различным РНК вирусного происхождения и окрашивание вирусного нуклеокапсида. Вирус присутствовал у 30 пациентов из 68 исследованных. Все (кроме одного) «информативные» случаи — пациенты, которым диагностировали COVID-19 в пределах 16 дней до смерти. В слизистой дыхательной области вирус в основном определялся в реснитчатых клетках и, в некоторых случаях, в клетках выстилки протоков желез слизистой, причем в трех случаях это были единственные клетки, где был обнаружен вирус (рис. 4, K, L).

Рис. 4. Распределение SARS-CoV-2 в слизистой дыхательной области пациентов, погибших от COVID-19. Верхний ряд: вирус присутствует во внешнем слое клеток слизистой дыхательной области. G — РНК нуклеокапсида вируса (SARS-CoV-2-N-sense, смысловые пробы "sense’ гибридизуются с антисмысловой РНК, отражающей репликацию вируса; зеленый) встречается совместно с РНК SARS-CoV-2-orf1ab, кодирующей неструктурные белки вируса (красный). H — РНК нуклеокапсида вируса (SARS-CoV-2-N-sense; зеленый) и РНК мембранного белка вируса (SARS-CoV-2-M) встречаются совместно с сигналом от мРНК FOXJ1 — маркером клеток мерцательного эпителия (красный). I — РНК вирусных частиц SARS-CoV-2-orf1ab-sense (красный) встречается совместно с сигналом мРНК FOXJ1 (зеленый). MUC5AC (синий) — белок, присутствующий в бокаловидных клетках эпителия и выделяемом ими секрете. J — РНК спайк-белка (SARS-CoV-2-S-sense; красный) встречается совместно с сигналом от мРНК FOXJ1 (зеленый), а также белком KRT7 (синий) — маркерами клеток мерцательного эпителия. K и L — РНК вируса (SARS-CoV-2-N (К) и SARS-CoV-2-orf1ab-sense (L), красный) присутствует в клетках выстилки протоков слизистой, в которых экспрессируется белок KRT8 — маркер протоков желез. Белым цветом обозначены ядра клеток (DAPI).

В 6 из 30 «информативных» случаев вирус обнаружили в клетках слизистой обонятельной области (рис. 5). Авторы использовали большое количество различных маркеров обонятельных нейронов для того, чтобы детально изучить распределение вируса: мРНК ANO2, CNGA2, GNAL, GNG13, OMP, а также генов обонятельных рецепторов и белок TUBB3. Это позволило детально изучить распределение вируса в слизистой.

Рис. 5. Распределение SARS-CoV-2 в слизистой обонятельной области пациентов, погибших от COVID-19. D — белок нуклеокапсида вируса (NUCLEOCAPSID; красный) отсутствует в обонятельных нейронах, экспрессирующих белок TUBB3 (зеленый), но зато обнаруживается в некоторых поддерживающих клетках. Интересно, что поддерживающие клетки, экспрессирующие мРНК UGT2A1 (синий), кодирующую белок UDP (глюкороназилтрансферазу), не инфицированы. E — в инфицированных поддерживающих клетках, содержащих РНК нуклеокапсида вируса (SARS-CoV-2-N; красный), снижен или отсутствует сигнал других маркеров этих клеток: белка ERMN (зеленый) и мРНК UGT2A (синий). F — SARS-CoV-2 способен реплицироваться в инфицированных поддерживающих клетках, об этом свидетельствует присутствие SARS-CoV-2-orf1ab-sense РНК (красный) и белка нуклеокапсида (синий). Тем не менее, уровень экспрессии мРНК GPX3 (зеленый) — маркера поддерживающих клеток — снижен, как и на изображении E. G, H и I — в обонятельных нейронах слизистой обонятельной области отсутствует сигнал реплицирующегося вируса SARS-CoV-2 (РНК SARS-CoV-2-S-sense; красный). Обонятельные нейроны помечены пулом мРНК генов обонятельных рецепторов (OR5A1, OR5AN1, OR7C1 и OR11A1, зеленый). KRT8 — маркер поддерживающих клеток обонятельного эпителия (синий). Реплицирующийся SARS-CoV-2 (РНК SARS-CoV-2-S-sense; красный) отсутствует в обонятельных нейронах, экспрессирующих белок TUBB3 (синий) и мРНК OR7C1. Белым цветом обозначены ядра клеток (DAPI).

Пациент №8 умер от коронавирусной инфекции через 4 дня после постановки диагноза. Полученные от него образцы слизистой обонятельной области оказались самыми информативными. Авторы обнаружили, что клетки обонятельных нейронов не содержат следы нуклеокапсидного белка вируса. В тканях этого пациента этот белок присутствовал преимущественно в поддерживающих клетках (рис. 5, D, Е), которые экспрессируют соответствующие маркеры UGT2A1 и ERMN. Интересно, что в инфицированных клетках интенсивность сигнала ниже. Это связано с тем, что инфекция SARS-CoV-2 приводит к снижению уровня трансляции и транскрипции клеток. Особенно это видно на примере рис. 5, F: поддерживающая клетка заполнена сигналом от нуклеокапсидного белка вируса, а также РНК SARS-CoV-2-orf1ab-sense, но в ней отсутствуют сигнал от мРНК GPX3 (глутатион пероксидазы), характерный для поддерживающих клеток и клетки Боуменовой железы. Поддерживающие клетки способны к фагоцитозу, поэтому использование нуклеокапсидного белка и антисмысловой РНК вируса показывает, что в них действительно находятся реплицирующиеся вирусные частицы, а не просто захваченный мусор.

Несмотря на все усилия, авторы не обнаружили признаков вируса в обонятельных нейронах: ни окрашиванием белка нуклеокапсида, ни поиском соответствующих вирусных РНК. На срезе слизистой обонятельной области (рис. 5, G–I) видно, что сигнал от вирусных РНК находится во внешнем слое и совпадает с клетками, где экспрессируется белок KRT8 — маркер поддерживающих клеток. Клетки нижнего слоя, соответствующие мРНК обонятельных рецепторов, находятся ниже и не совпадают с сигналом от вирусной РНК. Авторы провели такой же анализ биопсий других пациентов. У двоих из них было невозможно изучить материал по причине повреждения, однако анализ сохранного материала показал такие же результаты. Это подтверждает результаты анализа мРНК обонятельной системы, показывающего, что обонятельные нейроны не инфицируются SARS-CoV-2.

Наконец были исследованы образцы обонятельной луковицы. Авторы использовали в качестве маркеров белки SSTR2A (маркер паутинной и мягкой оболочек головного мозга, покрывающих обонятельную луковицу) и TUBB3 (который экспрессируется в нейронах), а также мРНК PECAM1, которая экспрессируется в выстилке сосудов.

В 11 случаях из 30 были обнаружены следы присутствия вируса, однако он поражал только клетки мягкой оболочки головного мозга, состоящей из соединительной ткани, а также выстилку сосудов — известную мишень SARS-CoV-2. В паренхиму обонятельной луковицы, где располагаются нейроны и их синапсы, вирус не попадает (рис. 6).

Рис. 6. В — вирус SARS-CoV-2 отсутствует в паренхиме обонятельной луковицы, в которой находятся аксоны обонятельных нейронов и нейронов обонятельной луковицы (TUBB3, синий). Вирус детектировали с помощью проб к РНК (SARS-CoV-2-N; красный). Его частицы присутствуют в клетках мягкой и паутинной оболочки (экспрессирующих белок SSTR2A, зеленый). С — белок нуклеокапсида (NUCLEOCAPSID; красный) и РНК (SARS-CoV-2-N; красный) вируса располагаются во внешнем слое обонятельной луковицы. D — вирус (SARS-CoV-2-S; красный) также присутствует в клетках выстилки сосудов, экспрессирующих мРНК PECAM1 (зеленый). Кровеносный сосуд разрезан наискосок. E — вирус SARS-CoV-2 присутствует в частично отошедшей мягкой оболочке (SSTR2A, зеленый). Белок TUBB3 (синий) маркирует нейроны обонятельной луковицы. Вирус детектировали с помощью проб к РНК (SARS-CoV-2-N; красный). F — еще у одного пациента был обнаружен сигнал вируса (SARS-CoV-2-M; красный) в мягкой оболочке, пронизанной кровеносными сосудами (маркированы мРНК PECAM1, зеленый). G — при анализе обонятельной луковицы еще одного пациента обнаружено присутствие вирусных частиц (SARS-CoV-2-N, зеленый, и SARS-CoV-2-S, красный) в переходной зоне между мягкой и паутинной и твердой мозговой оболочками. Белым цветом обозначены ядра клеток (DAPI).

Из всех полученных результатов авторы делают вывод, что SARS-CoV-2, вероятно, не поражает обонятельные нейроны заболевших, и что его основной мишенью являются поддерживающие клетки обонятельной области. Учитывая, что эти клетки выполняют множество функций (не только структурную, но и функции фагоцитоза и выведения токсичных веществ), причем многие из этих функций практически не изучены у человека, не исключено, что заражение этих клеток и нарушение их работы приводит к нарушению функции нейронов. Эти результаты подтверждают ранние сообщения о том, что именно эти клетки экспрессируют рецептор ACE2.

Тем не менее, полученные результаты противоречат более ранним публикациям, которые описывали заражение обонятельных нейронов. Например, немецкие исследователи обнаружили наибольший уровень вирусной РНК у пациентов, скончавшихся от COVID-19, в слизистой обонятельного поля ровно под решетчатой пластинкой и обонятельной луковицей (J. Meihard et al., 2021. Olfactory transmucosal SARS-CoV-2 invasion as a port of central nervous system entry in individuals with COVID-19). Вирусная РНК детектировалась с помощью РНК гибридизации in situ, а вирусные частицы — с помощью электронной микроскопии. Распределение вирусных частиц в различных типах клеток слизистой обонятельной области изучали с помощью окрашивания антителами к маркерам обонятельных нейронов и к S-белку SARS-CoV-2, а последнее может неспецифично взаимодействовать с другими антигенами, приводя к артефактам. Кроме того, отсутствовали данные о возможной репликации вируса в обонятельных нейронах.

Авторы учитывают возможность того, что обонятельные нейроны могут быть инфицированы у некоторых пациентов или на каком-то этапе заболевания. На самом деле утверждение, что SARS-CoV-2 не способен заражать нейроны, — это очень смелое заявление, особенно в свете существования немалого количества работ о способности вируса проникать в нервную ткань. Одно из примечательных исследований — работа американских биологов, которая продемонстрировала возможность заражения использованием клеточных органоидов мозга, которые хорошо отражают процессы, происходящие в организме. Поэтому явно требуется дальнейшее изучение не только того, какие клетки заражает SARS-CoV-2, но и какие последствия это имеет для пациентов.

Также пока непонятно следующее: раз SARS-CoV-2 не поражает обонятельные нейроны, то как же вирусные частицы попали в мягкую оболочку, окружающую обонятельную луковицу? Авторы считают, что обнаруженные вирусные частицы — это целые вирусы, которые не обязательно находятся в клетке, ведь РНК реплицирующихся вирусов они не обнаружили. Вирусы попали туда либо через спинномозговую жидкость, передвигаясь вдоль поверхности, но не внутри аксонов обонятельных нейронов, либо уже из крови пациентов, «протиснувшись» через сосуды мозговых оболочек.

Обсуждаемое исследование оставляет и другие вопросы. Как поражение поддерживающих клеток влияет на обонятельные нейроны? Может ли все же вирус попадать в головной мозг через них? И конечно же, как эти результаты могут помочь переболевшим SARS-CoV-2 восстановить обоняние?

Источник: M. Khan et al. https://www.cell.com/ // Cell. 2021. DOI: 10.1016/j.cell.2021.10.027.